體外重組蛋白表達(dá)技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的各個領(lǐng)域。目前，體外重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要有四類：原核表達(dá)系統(tǒng)、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)、酵母表達(dá)系統(tǒng)及昆蟲細(xì)胞表達(dá)。表達(dá)的一般實驗包括載體構(gòu)建-表達(dá)鑒定-蛋白純化三大步驟。在構(gòu)建載體階段，除了一些必要的表達(dá)元件，還需要考慮的密碼子優(yōu)化和標(biāo)簽的選擇。選擇合適的標(biāo)簽不但有利于蛋白的純化，促進(jìn)蛋白的可溶性，同時也不能影響蛋白的結(jié)構(gòu)功能和下游應(yīng)用。本文詳細(xì)介紹了幾種蛋白純化標(biāo)簽，幫助我們更好的設(shè)計實驗。

一，蛋白純化標(biāo)簽比較

二，HIS-Tag（組氨酸標(biāo)簽）

His標(biāo)簽主要用來融合表達(dá)的，其原因主要有：

1，HIS-Tag本身的特性對目的蛋白沒有影響，不會形成二聚體；

2，分子量較小，只有0.84KD，對蛋白的下游應(yīng)用不會產(chǎn)生影響；

3，免疫原性低，可將純化的蛋白直接注射動物進(jìn)行免疫并制備抗體；

4，HIS-Tag與細(xì)菌的轉(zhuǎn)錄翻譯機(jī)制兼容，有利于蛋白表達(dá)；

5，可與其他標(biāo)簽構(gòu)建雙標(biāo)簽表達(dá)，可用于多種蛋白表達(dá)系統(tǒng)，純化條件溫和對蛋白影響較小。

HIS-Tag由6-10個組氨酸殘基組成，分子量不到0.84KD，通常插入在目的蛋白的C末端或N末端。HIS-Tag是目前原核表達(dá)常用的標(biāo)簽，蛋白純化完之后可以不需切除此標(biāo)簽，也不會對蛋白產(chǎn)生功能影響。同時，蛋白純化步驟簡便，純化條件溫和，對蛋白也不會產(chǎn)生太大影響。

三，GST-Tag（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶標(biāo)簽）

GST-Tag相對分子質(zhì)量較大，約為26KD，插入在目的蛋白的C末端或N末端，大腸桿菌中常用在N端。GST(谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶) 蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉(zhuǎn)移酶。一般選擇GST標(biāo)簽的目的有兩個，一是提高蛋白表達(dá)的可溶性，二是提高蛋白的表達(dá)量。蛋白表達(dá)純化結(jié)束后需根據(jù)不同的蛋白應(yīng)用而確定是否切除標(biāo)簽，標(biāo)簽較大，切除與否需根據(jù)下游應(yīng)用考慮。如果要去除GST融合部分，可用位點特異性蛋白酶切除。檢測方法可用GST抗體或表達(dá)的目的蛋白特異性抗體檢測。

GST-Tag的優(yōu)缺點

1，增加外源蛋白的可溶性；

2，可在不同的宿主中表達(dá)，適用范圍廣；

3，可用不同的蛋白酶可以方便去除；

4，很好保留了蛋白的抗原性和生物活性，提高外原蛋白的穩(wěn)定性；

5，高特異性，純化方便且溫和；

6，分子量較大，可能會影響蛋白質(zhì)的功能和下游實驗；

7，如果蛋白不可溶，很難用變性的方法純化。

GST親和純化原理

GST 親和層析^[1] 是利用GST 融合蛋白與固定的谷胱甘肽(GSH)通過硫鍵共價親和，通過GSH交換洗脫的原理來進(jìn)行純化 。該純化柱中，凝膠手臂上通過硫鍵結(jié)合一個谷胱甘肽。然后利用谷胱甘肽與谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（即GST-tag（26 KDa））之間酶和底物的特異性作用力，使得帶GST標(biāo)簽的融合蛋白能夠與凝膠上的手臂谷胱甘肽結(jié)合，從而將帶標(biāo)簽的蛋白與其他蛋白分離開。谷胱甘肽通常有氧化型GSSG和還原型GSH，當(dāng)我們使用GSH洗脫時，GSH會與凝膠上的谷胱甘肽競爭結(jié)合融合蛋白，從而將目標(biāo)蛋白洗脫。GST標(biāo)簽蛋白可直接從細(xì)菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione sepharose)親和樹脂進(jìn)行純化。GST標(biāo)簽蛋白可在溫和、非變性條件下洗脫，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在變性條件下會失去對谷胱甘肽樹脂的結(jié)合能力，因此不能在純化緩沖液中加入強(qiáng)變性劑如：鹽酸胍或尿素等。如果蛋白表達(dá)在包涵體中，可復(fù)性后再純化。此外要去除GST標(biāo)簽，可用位點特異性蛋白酶切除。

四，MBP-Tag（麥芽糖結(jié)合蛋白標(biāo)簽）

MBP（麥芽糖結(jié)合蛋白maltose binding protein）， 殘基數(shù)346，分子量42.5KDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼，構(gòu)建時刻放在N端，用來提高可溶性（尤其是真核蛋白）。MBP的折疊需要DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES兩個分子伴侶系統(tǒng)的幫助，這可以使這些分子伴侶聚集到目的蛋白的附近幫助其正確折疊。另外，以標(biāo)簽蛋白形式存在的麥芽糖結(jié)合蛋白可以減少目的蛋白的降解，提高表達(dá)產(chǎn)物的水溶性，也為以后對目的蛋白的純化提供了基礎(chǔ)。麥芽糖結(jié)合蛋白能夠被多糖樹脂吸附，因此在過柱時，能夠使融合蛋白與其它蛋白成份分離。

MBP標(biāo)簽的優(yōu)缺點：

1，簡單親和純化即可實現(xiàn)；

2，增加蛋白表達(dá)量和蛋白穩(wěn)定性；

3，促進(jìn)蛋白的可溶性和正確折疊；

4，標(biāo)簽較大，對蛋白的結(jié)構(gòu)/功能會有一定影響。

五，NusA-Tag（轉(zhuǎn)錄終止/抗終止蛋白標(biāo)簽）

NusA是大腸桿菌自身的一種蛋白，即轉(zhuǎn)錄抗終止因子，殘基數(shù),495，分子量:54.87KDa，由1999年Davia將NusA從4000種大腸桿菌蛋白庫中篩得。NusA不具有獨立的純化標(biāo)簽功能，所以要與其它標(biāo)簽(如His標(biāo)簽)聯(lián)用。利用原核表達(dá)時，NusA標(biāo)簽可以明顯的提高蛋白的可溶性，例如含有NusA標(biāo)簽的人白介素-3 融合蛋白(NusA/hIL-3 )在37℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)幾乎全部可溶(97%)，而當(dāng)其單獨表達(dá)或融合GST標(biāo)簽表達(dá)時都是包涵體形式。另外NusA標(biāo)簽還可以提高不溶性靶蛋白如牛生長激素（bGH)、人干擾素-γ (hIFN-γ)的可溶性。來自草木犀根瘤菌(Rizobiummeliloti)的酪氨酸激酶因為分子量大(超過54kDa)并且基因含有大量稀有密碼子，自身在大腸桿菌中無法過量表達(dá)，但是與NusA融合后卻可以高效表達(dá)。

NusA的優(yōu)缺點：

1，可以提高蛋白質(zhì)的溶解性，可選的標(biāo)簽有NusA，MBP，GST；

2，這些標(biāo)簽不能用專門的親和基質(zhì)純化，融合蛋白構(gòu)建時必須與可用于純化的小親和標(biāo)簽連用。尤其是當(dāng)NusA蛋白增加融合蛋白溶解性時，一些在大腸桿菌中表達(dá)為不溶性的蛋白在與NusA在N端融合時則變成可溶。但是由于它的分子量較大，導(dǎo)致靶蛋白的得率相對降低；

3，NusA本身不具有獨立的純化標(biāo)簽功能，所以要與其它標(biāo)簽如His標(biāo)簽聯(lián)用；

4，NusA對蛋白下游應(yīng)用會有影響，如蛋白需進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析（晶體衍射或核磁共振）。

六，SUMO（小泛素相關(guān)修飾物）

    SUMO標(biāo)簽蛋白是一種小分子泛素相關(guān)修飾蛋白，是存在于真核生物中高度保守的參與蛋白質(zhì)小泛素化相關(guān)修飾的一類大蛋白。與GST、MBP或NusA相比，SUMO不僅可以作為重組蛋白表達(dá)的融合標(biāo)簽還具備分子伴侶的功能，能促進(jìn)蛋白的正確折疊，對熱和蛋白酶具有耐受性，更有助于保持目的蛋白的穩(wěn)定性。此外，SUMO標(biāo)簽有著與其配套的蛋白酶（專一性強(qiáng)），此蛋白酶識別的是SUMO的三級結(jié)構(gòu)，切割的特異性高，不存在任何氨基酸的殘留，因此適用于重組蛋白表達(dá)。

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