子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中 qPCR、分子克隆、下一代測(cè)序等都需要進(jìn)行DNA提取。
如今，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都使用商業(yè) DNA 提取試劑盒，這些試劑盒使用硅膠自旋過濾法來獲得高質(zhì)量的 DNA。這些可以快速有效地純化 DNA（或 RNA），在這里需要先了解一下DNA 提取試劑盒的工作原理。
核酸提取試劑盒的工作原理
離心柱包含一種硅膠樹脂，可根據(jù)鹽條件和受提取方法影響的其他因素選擇性地結(jié)合 DNA 和 RNA。這些 DNA 提取試劑盒使整個(gè)過程比舊的 DNA 分離方法更容易、更快。但是，使用套件的缺點(diǎn)是，如果您不了解套件的黑匣子中的內(nèi)容，則會(huì)使故障排除變得更加困難。
RNA和DNA提取裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點(diǎn)是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會(huì)破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑，以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。溶菌酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型，也可以使用酶進(jìn)行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，實(shí)際上在這些變性緩沖液中效果較好；當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)變性增多，蛋白酶 K 的作用也會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。然而，溶菌酶在變性中不起作用，因此溶菌酶處理通常在添加變性鹽之前進(jìn)行。關(guān)于質(zhì)粒制備的注意事項(xiàng)分離質(zhì)粒 DNA 與提取 RNA 或基因組 DNA 的提取方式是不相同的，因?yàn)楸仨氋|(zhì)粒與基因組 DNA 必須分離。如果此刻，您加入離液劑將立即釋放所有物質(zhì)，并且無法將小環(huán)狀 DNA 與高分子量染色體區(qū)別開來。因此，在質(zhì)粒制備過程中中，直到裂解后才加入離液劑，鹽用于結(jié)合。DNA 提取后純化：將 DNA 與色譜柱結(jié)合離液鹽對(duì)于裂解至關(guān)重要，而且對(duì)于將 DNA（或 RNA）與色譜柱結(jié)合也是如此。此外，為了增強(qiáng)和影響核酸與二氧化硅的結(jié)合，還添加了酒精。大多數(shù)情況下這是乙醇，但有時(shí)可能是異丙醇。乙醇百分比和體積有很大的影響。太多，你會(huì)帶入大量降解的核酸和小物種，這會(huì)影響 A260 讀數(shù)并降低你的一些產(chǎn)量。太少，可能難以從膜上洗掉所有鹽分。如果您在裂解中使用含有 SDS 的去污劑，請(qǐng)嘗試使用NaCl 作為沉淀劑，以避免去污劑污染 DNA 或 RNA。洗滌 DNA（或 RNA）當(dāng)裂解物通過硅膠膜進(jìn)行離心分離，現(xiàn)在所提取的 DNA 或 RNA 應(yīng)該與柱子結(jié)合，雜質(zhì)、細(xì)胞蛋白和多糖應(yīng)該已經(jīng)通過了。 但是，膜仍然被殘留的細(xì)胞蛋白質(zhì)和鹽弄臟。如果樣品來自植物，仍然會(huì)有多糖，也許一些色素留在膜上，或者如果樣品是血液，膜可能會(huì)被染成棕色或黃色。
通過洗滌的方法去除雜質(zhì)通常有兩次洗滌，盡管這可能因樣品類型而異。初次洗滌通常會(huì)含有少量的離液鹽，以去除蛋白質(zhì)和有色污染物。 這之后總是用乙醇洗滌以除去鹽。如果開始的準(zhǔn)備工作沒有大量蛋白質(zhì)，例如質(zhì)粒準(zhǔn)備或 PCR 清理，則只需要乙醇洗滌。去除離液鹽對(duì)于獲得高產(chǎn)量和高純度的 DNA 或 RNA 至關(guān)重要。一些試劑盒甚至?xí)靡掖记逑粗觾纱巍?/span>
如果殘留鹽分，核酸的洗脫會(huì)很差，A230讀數(shù)會(huì)很高，導(dǎo)致260/230的比率很低。對(duì)于無乙醇 DNA 和 RNA，需要進(jìn)行干法離心，乙醇洗滌后，大多數(shù)方案都有一個(gè)離心步驟來干燥柱子。這是為了去除乙醇，對(duì)于清潔的洗脫液是必要的。
當(dāng)將 10 mM Tris 緩沖液或水應(yīng)用于膜進(jìn)行洗脫時(shí)，核酸會(huì)水合并從膜中釋放出來。如果色譜柱上仍有乙醇，則核酸無法再與水融合。如果跳過干燥步驟會(huì)導(dǎo)致乙醇污染和低產(chǎn)量。很可能在 Nanodrop 上看不到乙醇吸光度，所以它不會(huì)出現(xiàn)在您的讀數(shù)中。
RNA 和 DNA 提?。合疵摲?/strong>
DNA 提取方案的還剩余IDE步驟步就是從硅膠中釋放純 DNA 或 RNA。
對(duì)于 DNA 制備，通常使用 pH 值為 8-9 的 10 mM Tris。DNA 在弱堿性 pH 值下更穩(wěn)定，在緩沖液中溶解得更快。即使對(duì)于 DNA 顆粒也是如此。水的 pH 值往往較低，低至 4-5，并且高分子量 DNA 在用于洗脫的短時(shí)間內(nèi)可能無法再與水結(jié)合。
通過在離心前讓緩沖液在膜中停留幾分鐘，可以較大限度地洗脫 DNA。
由于RNA 易溶于水，且RNA 利于處在微酸性的 pH 值環(huán)境下。
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