MDCK細(xì)胞屬于動物細(xì)胞一般采用Cytodex 作為微載體Cytodex 主要有兩個系列 即：Cytodex 和 Cytopore ，其中 Cytodex 1適合大多數(shù)的貼壁細(xì)胞。

采用Cytodex 微載體的優(yōu)勢主要有以下幾點(diǎn)：

1. Cytodex 微載體的表面比較適宜細(xì)胞的粘附和延展。

2. 優(yōu)化后的大小和密度對于細(xì)胞懸浮較為有利，適宜細(xì)胞的生長和高產(chǎn)。

3. 這類細(xì)胞的細(xì)胞基質(zhì)具有一定的生物惰性，可以減少攪拌培養(yǎng)過程中的剪切力損害。

4. Cytodex 微載體具有較好的可放大性。試驗(yàn)證明，良好的培養(yǎng)環(huán)境下采用搏旅懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器可達(dá) 15,000 L產(chǎn)量規(guī)模，而采用貼壁細(xì)胞微載體培養(yǎng)生物反應(yīng)器可達(dá) 6,000 L 左右的規(guī)模。

MDCK細(xì)胞的生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)方法主要有以下幾個步驟：

一、微載體的前處理：

用pH為7.4的PBS緩沖液將Cytodex系列微載體浸泡3~24H;反復(fù)清洗后用高壓進(jìn)行滅菌，冷卻。并用含牛血清的培養(yǎng)基清洗后并加入同體積的培養(yǎng)基備用。2）

二、MDCK種子細(xì)胞的解凍復(fù)蘇：

取出凍存中MDCK細(xì)胞，置于37℃-39℃的恒溫水浴振蕩器中進(jìn)行解凍復(fù)蘇，再植入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。

三、細(xì)胞的轉(zhuǎn)瓶擴(kuò)培

當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞生長到90%密度時用細(xì)胞消化液處理細(xì)胞，并接入搖瓶進(jìn)行分瓶培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長到同樣密度時，用培養(yǎng)基稀釋接入生物反應(yīng)器進(jìn)行擴(kuò)培。

四、生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)：

MDCK細(xì)胞接種可以依照 比例為2-25g微載體/L（培養(yǎng)基）、5-50個細(xì)胞/載體的比例接入生物反應(yīng)器中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。具體詳盡參數(shù)可以根據(jù)相關(guān)的《胞培養(yǎng)操作說明》進(jìn)行設(shè)定調(diào)整。

五、病毒的感染接種：

當(dāng)生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞90%在微載體表面形成致密層后，應(yīng)當(dāng)停止攪拌，當(dāng)微載體沉淀于生物反應(yīng)器的地步是，更新培養(yǎng)基，按照TPCK胰酶1-20μg/ml、病毒感染復(fù)數(shù)0.01-1接種病毒培養(yǎng)2h后，補(bǔ)充培養(yǎng)基與原來的量相一致；

六、病毒收獲

當(dāng)病毒接種10H后，需要每小時取樣觀察細(xì)胞的病變效應(yīng)及CPE值，當(dāng)CPE值大達(dá)80%以上時，即可進(jìn)行病毒收獲、分析測定等操作環(huán)節(jié)，結(jié)合分析結(jié)果與相關(guān)《檢驗(yàn)規(guī)程》執(zhí)行下一步操作。

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